Avancées technologiques en microscopie à fluorescence
Introduction
La microscopie à fluorescence (MF) a révolutionné la recherche dans l'ensemble des sciences de la vie. Elle offre un aperçu sans précédent des structures et processus biologiques dynamiques, de l'échelle moléculaire à l'échelle de l'organisme, transformant notre compréhension de l'organisation, des mécanismes, des interactions et du développement cellulaires et subcellulaires. Bien qu'elle existe depuis plus de 100 ans, les progrès technologiques extraordinaires réalisés au cours des 30 dernières années ont fait de la MF un outil d'imagerie puissant et abordable, accessible à pratiquement tous les laboratoires.
L'émergence de la microscopie à fluorescence
L'histoire de la MF est définie par une volonté soutenue d'innovation ponctuée de moments clés. Les premiers microscopes à fluorescence, nés de l'avènement des microscopes UV au début des années 1900, ont concrétisé cinq décennies de spéculations et de discussions. Dans les années 1940 et 1950, l'immunologiste Albert Coons et ses collègues ont conjugué des composés fluorescents (fluorophores) à des anticorps primaires et secondaires pour détecter les antigènes, ce qui a donné naissance à l'imagerie par immunofluorescence (IF) moderne. La découverte en 1961 par Osamu Shimomura de la protéine fluorescente verte (GFP) dans les méduses a fourni un autre outil clé pour la MF, bien qu'elle n'ait été réalisée que trois décennies plus tard. La première itération du microscope à épifluorescence moderne est apparue en 1967 avec l'introduction de miroirs dichroïques séparant les faisceaux par Brumberg et Ploem.
Une explosion de la diversité des marqueurs fluorescents dans les années 1990 a marqué un tournant et le début d'un développement technologique rapide conduisant à une expansion massive des applications de la GFP. Le séquençage de la GFP et l'expression transgénique qui s'en est suivie ont ouvert de nouvelles perspectives dans le domaine de l'imagerie par fluorescence, permettant un marquage très ciblé des organismes vivants. Le développement de nombreuses variantes et d'autres protéines fluorescentes a rapidement suivi, tandis que les améliorations et la diversification simultanées des fluorophores synthétiques ont stimulé l'IF et d'autres applications auparavant entravées par les limites des colorants. Les suites de nouveaux colorants, tels que les colorants Alexa Fluor largement publiés, étaient plus photostables, insensibles au pH et plus brillants, conservant leur éclat lorsqu'ils étaient conjugués. L'augmentation de la gamme spectrale et de la diversité des fluorophores qui en a résulté a apporté plus de flexibilité, une imagerie plus profonde et des capacités de multiplexage améliorées.
Au cours des dernières décennies, les innovations en matière de microscopes, de systèmes d'éclairage, de méthodes, de chimie et de traitement de l'image ont continué à progresser rapidement, permettant des études de plus en plus complexes et à plus haute résolution. Par exemple, les interactions cellulaires ou moléculaires rapides peuvent être facilement observées en temps réel avec une haute résolution spatiale et temporelle à l'aide d'installations de paillasse abordables.
Considérations sur la conception de la fluorescence
Le succès des études d'imagerie par fluorescence dépend dans une large mesure de la sélection des marqueurs et de la technologie MF. Des considérations complexes orientent le choix du marqueur, notamment des facteurs interconnectés liés à l'expérience, à la technologie utilisée et au niveau de sensibilité et de spécificité requis. Les fluorophores synthétiques sont généralement conjugués à des molécules cibles, telles que des anticorps ou d'autres protéines et oligonucléotides, et se présentent sous la forme d'une large gamme de réactifs fluorophores et de conjugués préfabriqués. Les marqueurs fluorescents peuvent potentiellement interférer avec la fonction, la localisation ou la dynamique d'une cible, et doivent donc être soigneusement pris en compte pour l'application et la fonctionnalité.
Le multiplexage utilise des ensembles complémentaires de marqueurs pour imager simultanément plusieurs cibles ou événements. Il est essentiel pour de nombreuses études, mais nécessite des considérations supplémentaires, telles que l'intensité relative du signal et le potentiel de réactivité croisée. La cartographie des spectres d'excitation et d'émission des fluorophores afin d'éviter tout chevauchement spectral est essentielle pour obtenir des données fiables et a été simplifiée grâce à Fluorescence SpectraViewer, un outil en ligne gratuit.
Les anticorps restent la méthode de marquage la plus couramment utilisée pour la MF, en utilisant généralement des anticorps primaires qui se lient à l'antigène cible, lequel est ensuite lié à des anticorps secondaires conjugués à des fluorophores qui ciblent l'espèce hôte et la classe d'immunoglobuline de l'anticorps primaire. Si nécessaire, les cibles de faible abondance peuvent être amplifiées à l'aide de protéines liant la biotine, telles que la streptavidine, ou d'autres méthodes telles que l'amplification du signal par la tyramide (TSA). Dans certains cas, le marquage direct avec des anticorps primaires conjugués peut simplifier ou améliorer les protocoles, en particulier pour le multiplexage.
Les anticorps doivent être validés en termes de spécificité et de performances d'application (par exemple, immunohistochimie (IHC) ou immunocytochimie) afin de garantir des résultats précis et reproductibles. L'adsorption croisée visant à éliminer la réactivité croisée améliorera les performances, en particulier pour les études de multiplexage. L'utilisation d'espèces différentes pour les anticorps primaires est également nécessaire pour éviter la réactivité croisée.
De nombreuses technologies de MF varient principalement au niveau de l'éclairage et des systèmes de détection. Les microscopes à épifluorescence à champ large sont les plateformes les plus simples, les plus polyvalentes et les plus couramment utilisées, utilisant traditionnellement une source lumineuse intense à large spectre avec des filtres optiques pour éclairer l'échantillon. Ils sont rapides, faciles à utiliser, abordables et offrent une qualité d'image et une résolution suffisantes pour de nombreuses applications. Leur capacité d'imagerie rapide à des intensités lumineuses plus faibles les rend idéales pour l'imagerie des cellules vivantes, surtout si elles sont renforcées par des sources lumineuses LED modernes. La microscopie optique de coupe, telle que la microscopie confocale à feuille de lumière et la microscopie multiphotonique, intègre une illumination laser de haute intensité et limite la détection au plan focal. Cela permet de créer un ensemble de données tridimensionnelles en acquérant plusieurs plans dans la dimension z et de réduire la fluorescence de fond pour une imagerie à plus haute résolution. Les microscopes à feuille de lumière éclairent les échantillons uniquement le long du plan focal, en utilisant une fine feuille d'excitation laser perpendiculaire à la capture d'image pour une imagerie très rapide. Certains instruments sont multimodaux, avec la possibilité de changer de méthode d'illumination et/ou de détection. Même au sein des types de technologie, les instruments varient en fonction de paramètres importants tels que la sensibilité et l'efficacité, qui ont un impact sur la qualité des données et la conception de l'étude.
Tendances récentes
L'importance croissante accordée à la biologie des systèmes et la nécessité d'observer plus de six cibles simultanément ont conduit à une plus grande capacité de multiplexage, longtemps limitée par le chevauchement spectral dans les palettes de fluorescence. De nouvelles techniques et capacités de calcul ont donné naissance à l'imagerie "super-multiplex" et "ultra-multiplex" de 15 cibles ou plus. Ces méthodologies exploitent les caractéristiques contrastées des colorants dont les spectres d'émission se chevauchent, par exemple en mesurant les vibrations des liaisons chimiques ou la stabilité temporelle et/ou en appliquant des techniques algorithmiques avancées de démélange spectral.
. Le développement et l'utilisation des sources d'éclairage LED en MF ont connu un essor rapide, grâce à la nouvelle technologie des diodes et à l'augmentation constante de la puissance qui alimente son intérêt croissant pour diverses applications. Plusieurs avantages importants par rapport aux sources traditionnelles à lampe à arc contribuent à sa popularité. L'irradiance (intensité lumineuse) des LED rivalise désormais avec celle des lampes à arc pour les applications MF à large champ, mais elle est graduable, ce qui élimine le besoin de filtres de densité neutre. La vitesse d'imagerie est accrue sans obturateur ni roue à filtres, car les lampes peuvent être allumées et éteintes avec une précision de l'ordre de la microseconde et les filtres peuvent être appliqués à des diodes individuelles. L'éclairage à LED est également plus durable, avec une durée de vie supérieure d'au moins 1 à 2 ordres de grandeur à celle des lampes à arc, un dixième de la consommation d'énergie et aucun des risques pour la santé, la sécurité et l'environnement liés au mercure présent dans les lampes à arc.
L'un des principaux thèmes de l'éclairage par LED est la réduction de l'intensité, de la durée et de la quantité d'exposition lumineuse des échantillons, ce qui permet d'améliorer l'intensité du signal, de réduire le bruit et de minimiser les dommages causés aux échantillons. Les diodes sont disponibles dans des canaux de longueur d'onde discrets allant de 340 nm (UV) à 780 nm (proche IR) pour une illumination sélective et multicanal de longueur d'onde adaptée à une variété d'applications, y compris l'imagerie de cellules vivantes à grande vitesse, l'imagerie calcique, l'optogénétique et le transfert d'énergie par résonance de Förster, entre autres. Fréquemment appliqué à la microscopie à super-résolution comme éclairage de soutien pour prévisualiser les régions d'intérêt, l'éclairage LED a également été appliqué avec succès à la microscopie à illumination structurée avec une vitesse d'acquisition limitée à la caméra. L'éclairage sélectif de volume modulé spatialement à l'aide d'une source LED a également donné des résultats similaires à ceux de la microscopie à feuille de lumière. Bien que sa capacité à concurrencer l'illumination laser en MF soit encore très limitée, la lumière LED à faible cohérence produit moins d'artefacts de chatoiement ou d'ombre que les faisceaux laser à haute cohérence, ce qui pourrait améliorer la qualité de l'image.
Défis et innovations actuels
Dégâts photographiques
Le photoblanchiment (dommages causés par la lumière aux fluorophores) et la phototoxicité (dommages causés par la lumière aux cellules vivantes) sont des préoccupations constantes pour la plupart des applications en MF et dépendent à la fois de la durée et de l'intensité de l'illumination d'excitation. Le photoblanchiment empêche définitivement la fluorescence et est causé par des modifications de la structure moléculaire du fluorophore induites par les photons. La phototoxicité peut avoir un impact négatif sur la croissance, la réplication, la fonction et la viabilité des cellules. La plupart des tactiques d'atténuation de ces deux phénomènes consistent à limiter l'exposition à la lumière par des contrôles temporels, spatiaux, d'intensité et spectraux.
Les contrôles traditionnels de l'éclairage peuvent inclure des volets et des filtres pour la longueur d'onde, l'intensité lumineuse (densité neutre), le blocage des UV et la chaleur. À l'inverse, l'importante réduction de l'exposition à la lumière offerte par les sources LED programmables et hautement contrôlées a rendu ces sources inestimables pour l'imagerie en direct. Bien qu'une illumination plus longue à une intensité plus faible soit préférable, la lumière pulsée ou strobée à haute intensité cause moins de dommages que la lumière soutenue à haute intensité en raison de la période de repos des fluorophores excités. Les technologies MF qui limitent l'éclairage au plan focal, comme la feuille de lumière et la réflexion interne totale, constituent les options les plus douces et les plus efficaces en termes de lumière. Les grandes longueurs d'onde (par exemple, rouge-IR), comme celles utilisées pour la microscopie multiphotonique, sont considérablement moins dommageables que les longueurs d'onde à haute énergie (par exemple, UV-bleu).
Le choix de fluorophores présentant une meilleure photostabilité réduira le photoblanchiment et la phototoxicité associée. En outre, une meilleure efficacité de détection peut permettre d'obtenir des images avec un rapport signal/bruit plus élevé avec une illumination d'excitation plus faible. Enfin, les réactifs antifade peuvent réduire considérablement le photoblanchiment pour les échantillons vivants et fixes, en préservant l'intensité du signal dans le temps et sur l'ensemble du spectre. Les solutions antifade peuvent également réduire la phototoxicité de certains types d'échantillons.
Imagerie des cellules vivantes
Travailler avec des cellules vivantes comporte de nombreux défis. Les cellules vivantes doivent être maintenues dans leur état physiologique naturel et en bonne santé pour produire des résultats biologiquement pertinents. Les fonctions et processus cellulaires sont très sensibles aux conditions variables, notamment la température, le pH et l'oxygène, qui doivent être étroitement contrôlés pour obtenir des résultats fiables et reproductibles. Un incubateur pour cellules vivantes est nécessaire lorsque la température et/ou le mélange de gaz requis pour les cellules diffèrent considérablement de l'environnement ambiant. Les solutions de milieu commerciales peuvent également aider à maintenir la viabilité des cellules pendant le chargement des colorants, les lavages et l'imagerie dans des conditions ambiantes, tout en améliorant la clarté de l'image et le rapport signal/bruit.
Certaines techniques de fluorescence sont intrinsèquement nocives pour les cellules ou les échantillons de tissus, ce qui a conduit à des innovations continues en matière d'éclairage, comme indiqué ci-dessus, ainsi que de marqueurs. Les marqueurs fluorescents peuvent être toxiques pour les cellules vivantes - la phototoxicité des fluorophores résulte de l'irradiation et de la formation subséquente d'espèces réactives de l'oxygène dans la cellule, tandis que la chimiotoxicité résulte de la nature chimique du fluorophore lui-même. La toxicité varie en fonction du marqueur, du type de cellule et de l'organisme, et doit donc être évaluée lors des phases de planification. L'utilisation de colorants plus efficaces ou d'une imagerie plus sensible permettant de réduire les concentrations de colorants a été un facteur majeur dans la limitation de la toxicité des marqueurs.
Perméabilité
La perméabilité peut être un défi, que l'on travaille avec des cellules fixes ou vivantes. L'augmentation de la perméabilité des cellules fixées tout en maintenant l'intégrité des structures peut être facilitée et grandement simplifiée par les kits de fixation et de perméabilisation. Le marquage des cellules vivantes pose un plus grand défi, car les membranes cellulaires ne sont généralement pas perméables aux anticorps et la perméabilisation endommagera ou détruira les cellules vivantes. Les anticorps peuvent toujours être utilisés pour colorer les membranes cellulaires ou suivre les processus d'internalisation, ou encore par l'expression d'intrabodies (anticorps intracellulaires). Le plus souvent, les cellules vivantes sont marquées à l'aide de protéines fluorescentes ciblées ou de petits réactifs perméables à la membrane. Les protéines fluorescentes sont généralement introduites dans les cellules vivantes sous forme de constructions génétiques par des moyens tels que la transfection lipidique ou la transduction virale, après quoi l'ADN exogène est exprimé.
L'étiquetage des cellules vivantes peut être considérablement facilité par un certain nombre de réactifs commerciaux. Par exemple, les réactifs CellLight contiennent des constructions prêtes à l'emploi, principalement utilisées pour le marquage des organites, qui peuvent être ajoutées à une culture pour être absorbées par les cellules la nuit précédant l'imagerie, de la même manière qu'une coloration, ce qui élimine la nécessité de recourir à des techniques de biologie moléculaire. Une autre option pour le marquage intracellulaire consiste à utiliser des colorants perméables aux cellules qui forment des produits de réaction imperméables à l'intérieur des cellules, comme les réactifs CellTracker. Les fluorogènes tels que les indicateurs pHrodo qui fonctionnent comme des capteurs de pH intracellulaire, particulièrement utiles pour l'endocytose, la phagocytose et les études de séquestration, peuvent être utilisés dans une variété de formats pour différentes applications, comme un colorant pour mesurer le pH cytosolique ou conjugué à des ligands, des anticorps ou d'autres particules pour faciliter les études d'internalisation.
Augmentation du rapport signal-bruit
L'amélioration du rapport signal-bruit (RSB), qui a toujours été une préoccupation pour la recherche, a un impact sur la résolution pratique, la précision et la confiance dans les résultats ; elle a également l'un des impacts les plus directs sur la qualité perçue de l'image. Le RSB est fortement influencé par le microscope, notamment son éclairage, ses lentilles d'objectif, ses détecteurs et son alignement, ce qui fait de la technologie un facteur essentiel de la planification. En outre, le RSB est également influencé par la densité et/ou la luminosité du fluorophore. L'optimisation de l'éclairage et des marqueurs, y compris des conjugués et des spectres d'excitation et d'émission, peut améliorer considérablement le RSN.
De multiples réactifs commerciaux peuvent également contribuer à l'optimisation du RSN par l'amplification du signal ou la suppression du bruit. Le signal pour les cibles à très faible abondance peut être augmenté avec le TSA, qui offre une amplification de haute clarté et de haute définition. La combinaison du traitement TSA avec des colorants très performants peut augmenter la sensibilité et la précision de 10 à 200 fois par rapport aux méthodes standard. Le bruit peut être réduit à l'aide de solutions de blocage ou de suppresseurs de bruit de fond. Les protéines bloquantes sont déplacées par les anticorps à haute affinité tout en bloquant les interactions de moindre affinité afin de réduire les colorations non spécifiques. Elles peuvent être générales ou spécifiques à certains conjugués, comme les protéines liant la biotine. Les suppresseurs de bruit de fond généraux peuvent également être utiles lors de l'imagerie de cellules vivantes dans les canaux bleu, vert et rouge.
Conclusions
La microscopie à fluorescence fait partie intégrante de l'étude de la biologie spatiale et fonctionnelle et contribue depuis des décennies à remodeler la recherche dans des domaines clés des sciences de la vie. Le rythme stupéfiant de la croissance et du développement continue de permettre de nouvelles branches de recherche avec des capacités en expansion rapide. Les améliorations apportées aux instruments et à la chimie, ainsi que les systèmes d'éclairage plus sûrs, plus durables et plus cohérents, ajoutent de la puissance et de l'accessibilité financière aux installations de laboratoire, ce qui permet l'accès mondial à des outils de recherche et de diagnostic qui changent la donne. L'avenir est prometteur.
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